制限酵素断片 をインサートしたプラスミドのプラスミドマップ描画方法を説明します。
おおまかな手順
- 環状プラスミド を 制限酵素 で開環します。
- DNA を同じ 制限酵素 で消化した断片を作成します。
- ライゲーション を行います。
- ライゲーション産物 の プラスミドマップ を描画します。
- プラスミドマップ を調整します。
詳細操作手順
環状プラスミド を一つの 制限酵素 で開環します。
- メニューから Cloning -> Restriction Enzyme -> Enzyme Selection… を選択します。
- Enzyme Selection ダイアログ が表示されます。
- 制限酵素 を選択します。ここでは例として、BamHI にチェックします。
- 「Show Recognition Site…」をクリックします。
- Recognition Site ダイアログが表示されます。
- 左ペインに 制限酵素 BamHI の 認識部位 の数が表示されます。
- BamHI の チェックボックス にチェックします。
- 右ペインに BamHI の認識配列 と 切断部位、塩基位置 などが表示されます。
- この部位で 消化切断 するため、右ペインの 切断部位 にチェックします(複数指定可能)。
- メインフィーチャーマップ の 配列レーン と フィーチャーレーン にその位置が表示されます。
- Digestion をクリックします。確認メッセージ が表示されます。
- はい(y)をクリックします。
- Digestion List ダイアログが表示されます。
- Digestion List にある 消化断片 にチェックします(複数指定可能)。
- Load をクリックします。
- 確認メッセージ が表示されます。
- OKをクリックします。
- メインディレクトリ に 消化断片 が ロード されます。
- 環状プラスミド は、開環され 線状プラスミド となっています。
- Digestion List をクローズします。
- Recognition Site ダイアログをクローズします。
次に、プラスミドに挿入するDNA断片を作成します。
- DNA断片を得るために、ゲノム塩基配列 ををロードします。
- ここでは例として、Bsub_50kb.gbk をロードします。
- プラスミド と同様に、制限酵素 BamHI で 消化切断 します。Bsub_50kb.gbk には6か所の BamHI認識部位 があります。
- 操作は プラスミドの開環 と同様です。
- Select All をクリックします。
- すべての 認識部位 にチェックが入ります。
- Digestion をクリックします。
- 確認メッセージ が表示されます。
- はい(Y)をクリックします。
- Digestion List ダイアログ が表示されます。Select All をクリックします。
- Load をクリックします。
- 確認メッセージ が表示されます。
- OKをクリックします。
- メインディレクトリ に線状の 消化断 片が全部 ロード されています。
次に、開環された プラスミド と ゲノム消化断片 の ライゲーション を実行します。
- 開環された プラスミド を選択します。
- その フィーチャーマップ が表示されます。
- メニューからCloning -> Ligation -> Simple Ligation をクリックします。
- Ligationダイアログ が表示され、ライゲーション できる断片のリストが表示されます。
- pColdV-BamHI-1.gbk の1st ラジオボタン をオンにします。
- Bsub_50kb-BamHI-n.gbk のいずれかの2nd ラジオボタン をオンにします。Ligation をクリックします。
- 確認メッセージ が表示されます。
- はい(Y)をクリックします。
- Ligation List ダイアログ が表示されます。
- Select All をクリックします。
- Load をクリックします。
- 確認メッセージ が表示されます。
- OKをクリックします。
- メインディレクトリ に4つの ライゲーション産物配列 が ロード されます。
- Ligation List をクローズします。
- Ligation ダイアログ をクローズします。
- Ligation産物配列 の一つをクリックし、フィーチャーマップ に表示します。
インサートされた プラスミド の プラスミドマップ を描画します。
- メニューから Window -> Plasmid Map Viewer… をクリックします。
- 確認メッセージが表示されます。
- はい(Y)をクリックします。
- Select Insert DNA ダイアログ が表示されます。
- インサートされたされた断片を選択します。
- プラスミドマップ描画ダイアログ が表示されます。
- 「Plasmid + Insert」をオンにします。
- Insert DNA 欄のAddをクリックします。
- Plasmid Map Lane Style Setting ダイアログ が表示されます。
- 表示する フィーチャーキー を選択します。
- ここでは例として、CDS を選択します。
- Set をクリックします。
- Draw をクリックします。
- 右側の カンバス に インサート が 吹き出し となった プラスミドマップ が表示されます。
プラスミドマップの描画調整方法
インサート表示領域がカンバスから上にはみ出てしまう場合
ページのサイズを大きくするか、縦にします。
- Page Setup…をクリックします。
- ページ設定ダイアログが表示されます。
- 印刷の向きを「縦」にします。あるいは、用紙サイズを大きくします。
環状領域の半径を小さくします。
- Diameter of Circle を小さい値に変更します。
- Draw をクリックします。
インサート表示領域がカンバスから左右にはみ出てしまう場合
ページサイズを大きくするか、横にします。
- Page Setup…をクリックします。
- ページ設定ダイアログが表示されます。
- 印刷の向きを「横」にします。あるいは、用紙サイズを大きくします。
インサート領域のサイズを変更します。
- LengthおよびHeight of Insertの値を変更します。
- Drawをクリックします。