IMC: ゲノムを対象としたＰＣＲプライマーデザイン

Ｑ-RT PCR用のプライマーをデザインすべく、「ゲノムを対象とするＰＣＲプラ
イマーデザイン」で目的遺伝子の一部をピンクに反転させ、ゲノムに対して１５０ｂ
ｐ程度のＰＣＲ断片で１８－３０ｂｐ程度のプライマーデザインを実行しています。
５－６時間程度計算をしているようですが、最終的にプライマーはデザインできない
との結果となります。検索条件レベルを下げてみてもプライマーがデザインできませ
ん。10回程度検索をしていますが、どこに問題があるのでしょうか？

2010/10/19 「T大学Ｙさんからの質問」代理投稿しました。-Forum Administrator-

ゲノムの大きさにもよりますが、１個の遺伝子を増幅する程度では、
通常「数分」で結果を得ることができます。数千個の遺伝子をそれぞれ増幅する場合で
数時間程度かかります。

５～６時間というのは、明らかに異常に長いです。ゲノム配列の総塩基長はどの程度でしょうか？
また、その遺伝子周辺にリピートがあると設計できません。その場合は、
その遺伝子を含む周辺だけの配列にして設計すると設計できる可能性があります。
これは、このプライマー設計がゲノム上でユニークにPrimingするように設計しているためです。

また、添付ファイルの画像で赤で囲んだパラメータの数字を1000bp程度にすると
とりあえず、設計ができる可能性が高くなります。

IMC Developer

プライマーデザインの件です。私の使い方が間違っているのでしょうか。
ゲノムの全長は約300万base程度です。例えば、このゲノムのアルコール脱水素酵素
（ＡＤＨ）の遺伝子発現ｍＲＮＡ量をｑＲＴ－ＰＣＲで観察したいと考えておりま
す。
１）ゲノム上のＡＤＨのＣＤＳをＫＷで選択して、遺伝子を特定します。
２）特定したＡＤＨ遺伝子の全長あるいは一部をピンク反転させ、ゲノム対象プリ
マーデザインをクリックします。
３）プリマーの設定を、リアルタイムに最適な１５０ｂｐ長として設定し、３００ｂ
ｐ上・下流の範囲に設定、プライマーは１８～２７程度に設定して、スタートさせま
す。

2010/10/19 「T大学Ｙさんからの質問」代理投稿しました。-Forum Administrator-

> ３）プリマーの設定を、リアルタイムに最適な１５０ｂｐ長として設定し、３
> ００ｂ
> ｐ上・下流の範囲に設定、プライマーは１８～２７程度に設定して、スタート
> させま
> す。

１）、２）は問題ありませんが、「１５０ｂｐ長として設定し」の値は
設計画面のどの項目に入力されましたでしょうか？
IMCの場合は、PCRプロダクトの長さは、ピンク色に反転された領域として
自動的に設定されますので、別の項目に150を設定なさったのではないでしょうか？

IMC Developer

ターゲット領域をピンク(150 bp程度）に反転し、whole genomeパ
ラメータータブを開きましたが、amplify lengthが1000に設定されたままになってい
ます。ピンクに反転した領域の数値が自動入力されるのでしょうか？1000のままで走
らせていますが、やはり、２，３時間はかかりそうな雰囲気です。

2010/10/21「T大学Ｙさんからの連絡」代理投稿しました。-Forum Administrator-

IMCには、3種類のPCR Primer設計機能があります。

1. 領域を指定（ピンク色にドラッグして）して増幅するPrimer設計。1か所増幅。
2. あるフィーチャーキー（たとえば、ゲノム上の全CDS）を全部一括して増幅するPrimer設計。多数箇所増幅。
3. あるゲノムを指定した大きさの重なりあるPCR産物で完全にカバーするためのPrimer設計。多数箇所を増幅。

３が今回ご使用されたPrimer設計ツールですが、今回の目的には合わないと思います。

１．を使われるとよいと思います。

操作方法は
１．増幅したい中心領域（150bp程度）をマウスでドラッグして、ピンクに反転させます。
２．そのピンクの領域上でマウス右ボタンをクリックします。
　　　するとメニューが表示されます。
　　　上から2番目のメニューが、「PCR Primer Design」ですが、これを選択します。
３．例のパラメータが表示されます。
　　　Primer Search Rangeだけ100から300程度にセットして、Find Primer Pairをクリックします。
　　　1分以内に結果が表示されます。見つからない時は、上のパラメータの数字を次第に大きくします。

IMC Developer