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• フィーチャーレーン上で選択された領域をPCR増幅するためのプライマーを設計します

操作

領域指定

1. フィーチャーマップ上の任意の領域をマウスでドラッグします。
2. ドラッグした領域が赤で表示されます。
3. 

プライマー設計

1. フィーチャーマップ上で、マウスの右ボタンをクリックします。
2. ポップアップメニューが表示されます。
3. 
4. メニューから「PCR Primer Design」を選択します。 
5. 「PCR Primer Design」ダイアログが表示されます。
6. 

デフォールトとは異なる設定をする場合

1. PCR Primer Design ダイアログのShow Parametersをクリックします。
2. 詳細パラメータが表示されます。
3. 
4. 増幅する領域を変更する場合は「From:」と「To:」のフィールドに直接数値を入力し、「Change」ボタンをクリックします。
5. 増幅対象領域が変更されます。
6. プライマーのプライミングサイトを増幅領域の上流何塩基までの範囲で探索するかを変更するには、「Primer Search Range(Extra　Upstream Bases)(bp)」フィールドに直接数値を入力します。
7. この場合、プライマーはFrom:の塩基位置から遡り、このフィールドに入力された塩基数だけ上流までの範囲で探索されます。
8. 下流側も同様に設定します。
9. プライマーの塩基長の範囲は、「Primer　Size Range Max.」のフィールドに最小塩基長と最大塩基長を直接入力します。
10. プライマーのTm の範囲は、「Tm Range Min.」と「Tm Range Max.」フィールドに最小Tm 温度（℃）と最大Tm 温度（℃）を直接入力します。
11. プライマーのＧＣ含量の範囲は、「GC Range Min.」と「GC Range Max.」フィールドに最小ＧＣ含量（％）と最大ＧＣ含量（％）を直接入力します。
12. アニーリングオリゴ濃度を指定する場合は、「Annealing Oligo Concentration」フィールドに直接濃度（nM）を入力します。
13. 塩濃度を指定する場合は、「Salt Concentration」フィールドに直接円濃度（nM）を入力します。
14. プライマー自己相補性があるか否かを判定するスコアの閾値を示します。
15. 「Max Self　Complementarity」のフィールドスコア以下である場合はプライマーとして許容し、それよりスコアが大きい場合は自己相補性があるとしてプライマーとされません。
16. プライマー内の反復配列を検出する際、反復配列として認識しない最大の塩基長を「Max Sequence Repeats」フィールドに指定します。
17. すなわち、この塩基長より大きな塩基長をもつ同一の配列が2 箇所以上に存在する場合は、プライマーとされません。
18. プライマーペアの間のTm の差の最大値を、「Max Tm Differenece」フィールドに直接入力することにより、指定します。
19. 対象となるDNA 領域中に、プライミングサイトがあるか否かをチェックするために３種のパラメータが用意されています。
20. チェック用には、Blast1 が使われているため、パラメータはBlast のそれに準じています。
    • 「Cutoff Expectation Value」は検出の閾値となる期待値を示します。
    • 「Cutoff Percent Identity」は、プライマー塩基長のうち何パーセント以上の塩基が一致するかの閾値を示します。
    • 「Cutoff Overlap　Length」は、プライマーとプライミングDNA 配列が最低何塩基以上オーバーラップするべきかを示します。
21. 「Run」ボタンをクリックします。
22. 最適な PCR Primer Set がリストされたPrimer Design List Window が表示されます。
23. 
24. 最適なPrimer Setが設計できない場合はエラーメッセージが表示されます。
25. 
26. Primerを設計できない場合は、設計パラメータを変更して、再設計します。 

増幅領域の確認増幅領域の確認

1. Primer Set List の各行をクリックするとそのPrimer Setに対応する増幅領域がカラー表示されます。
2. 

PCR　増幅の実行

1. Primer Design　List　から使用するPrimer Setのチェックボックスにチェックします。
2. 
3. Amplify をクリックします。
4. 確認メッセージ「Start PCR」が表示されます。
5. 
6. Amplify List ウィンドウが表示されます。
7. リストには増幅産物がリストされます。
8. 

増幅産物のロード

1. 増幅産物をメインディレクトリに追加する場合は、その産物のチェックボックスにチェックします。
2. 
3. Loadをクリックします。
4. Loadが実行され、完了すると完了メッセージが表示されます。
5. 
6. カレントメインディレクトリにPCR産物の生成配列が追加されます。
7. 

増幅産物配列の閲覧

1. カレントメインディレクトリに追加されたPCR産物の配列をクリックします。
2. PCR産物のフィーチャーマップが表示されます。
3.